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    要做好CCK-8實(shí)驗(yàn),這三個(gè)重要環(huán)節(jié)請(qǐng)注意

    發(fā)布時(shí)間: 2024-04-17  點(diǎn)擊次數(shù): 1064次

    在做細(xì)胞基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)時(shí),必要的一步就是需要探究清楚細(xì)胞的增殖變化和毒性耐藥變化情況,為下一步實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。


    我們?cè)谧鯟CK-8增殖和毒性實(shí)驗(yàn)中常常會(huì)遇到一下幾個(gè)問題:

    1.細(xì)胞鋪板問題 2.給CCK-8的方式問題 3.CCK-8的反應(yīng)時(shí)間問題


    首先,在進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí), 需要用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),得到細(xì)胞數(shù)量后按照所需鋪板的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行調(diào)整。一般96孔板鋪板數(shù)量為1*10^6/孔。


    制備細(xì)胞懸液時(shí)需要反復(fù)吹打,使細(xì)胞懸液充分混勻,降低出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)塊的幾率。一般96孔板,每孔加入100微升細(xì)胞懸液,從孔的9點(diǎn)鐘方向打入,加入半張板子時(shí),需要再次將細(xì)胞吹勻,然后繼續(xù)加剩余的孔。


    待全部加入完畢時(shí),蓋上蓋子,放入培養(yǎng)箱。(細(xì)胞的均勻鋪被是本實(shí)驗(yàn)成功的大前提)。


    其次,是細(xì)胞的處理。一般給CCK-8有兩種方式:第一種是直接每孔加入10微升的CCK8原液;另一種則是配置含10%的CCK-8培養(yǎng)基,以換液的形式加入孔板。


    第一種方式的弊端在于10微升的CCK-8量比較少,可能因沾在孔壁導(dǎo)致誤差的出現(xiàn)。


    第二種方式可以避免上述情況的發(fā)生,但操作過程中仍需注意10%的CCK-8培養(yǎng)基需要現(xiàn)配現(xiàn)用;其次打入100微升的CCK-8時(shí)沿著孔壁將槍頭伸入液體緩緩打出,再移出槍頭。


    期間可能會(huì)產(chǎn)生小氣泡,需要用無菌針頭燒紅插入氣泡,消除氣泡。(氣泡會(huì)影響OD值,因此應(yīng)該盡量消除)。


    最后,就是反應(yīng)時(shí)間問題。將孔板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-4小時(shí),引細(xì)胞種類和數(shù)量的差異,可能形成的Formazan的量不一樣。因此需要把握好培養(yǎng)的時(shí)間。


    我的經(jīng)驗(yàn)是:在培養(yǎng)2h后,取出孔板,每孔抽取90微升加入至新孔板,進(jìn)行第一次檢測,看看顯色的深淺程度(仍然需要注意氣泡,若有氣泡需要待氣泡消除后再進(jìn)行檢測)


    若顯色較淺,則可除去舊培養(yǎng)基,加入新培養(yǎng)基,再培養(yǎng)1-4小時(shí),重新加CCK-8步驟,然后將其放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時(shí),再進(jìn)行檢測(其最佳反應(yīng)時(shí)間為0.5、1、2小時(shí))


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