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    小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制作實(shí)驗(yàn)

    發(fā)布時間: 2024-01-18  點(diǎn)擊次數(shù): 808次

    實(shí)驗(yàn)原理:

      在小鼠骨髓細(xì)胞中,有絲分裂旺盛,因此可以直接得到中期細(xì)胞而不必像血淋巴細(xì)胞那樣要經(jīng)過體外培養(yǎng)。骨髓細(xì)胞具有高度的分裂活性,經(jīng)秋水仙素(秋水仙堿)處理后,使分裂細(xì)胞阻斷在有絲分裂中期,再經(jīng)低滲處理、固定、滴片、染色等步驟,可制作較好的骨髓細(xì)胞的染色體標(biāo)本。通過骨髓得到染色體是比較簡便的,一般也無需無菌操作。在臨床上多用于白血病的研究,在實(shí)驗(yàn)條件下,這種染色體是機(jī)體內(nèi)真實(shí)情況的反映,而且用骨髓制片的方法易于觀察毒性物質(zhì)在體內(nèi)對細(xì)胞和染色體的影響。


    實(shí)驗(yàn)方法和步驟:

    (一)秋水仙素處理取骨髓前3-4h先給小白鼠經(jīng)腹腔注入0.1%的秋水仙素,注射劑量為4mg/kg動物體重。


    (二)取骨髓經(jīng)秋水仙素處理的小白鼠,可用損傷脊髓法(斷頸法)迅速處死,然后用剪刀剪開大腿上的皮膚和肌肉,取出大腿骨和脛骨,用一小塊紗布來回搓干凈附在骨上的肌肉33碎渣。剪掉股骨兩端膨大的關(guān)節(jié)頭,然后將股骨剪碎投入小燒杯中,用2毫升1%檸檬酸鈉溶液攪爛碎骨,使骨髓細(xì)胞游離出來。靜止片刻,用吸管把懸浮液吸到離心管中,可重復(fù)沖洗一次。此時離心管中的細(xì)胞懸浮液可達(dá)4-5毫升。


    (三)低滲將所獲得的細(xì)胞懸浮液先進(jìn)行平衡(注意:每次離心前都要平衡),然后以1000rpm離心10min,吸去上清液,留0.2ml沉淀物,加0.075M KCL溶液至8毫升刻度,將細(xì)胞沉淀物吹散打勻,在水浴37℃低滲20-30min。


    (四)固定低滲處理后的材料,以1000rpm離心10min,吸去上清液,留0.2ml沉淀物,用吸管吹散沉淀物,沿管壁加固定液至6毫升,沖勻后靜止固定20min,即第一次固定。按上述條件離心,去上清液,再次加入固定液至6ml,進(jìn)行第二次固定。20min后離心吸去上清液,留0.2ml沉淀物,再往沉淀物中滴加4滴固定液,沖勻制成細(xì)胞懸液。


    (五)滴片取事先在冰箱中預(yù)冷的載玻片(載玻片須經(jīng)硫酸洗液浸泡10天以上,經(jīng)清水沖洗,用蒸餾水浸泡),滴2-3滴細(xì)胞懸液于粘有冰水的載玻片上,用嘴吹氣,使細(xì)胞迅速分散。將載片插放在切片架上晾干。


    (六)染色取2張制片平放在玻璃板上,用10:1 Giemsa染液染色20min,流水沖洗后晾干即可鏡檢(也可以使用苯酚品紅溶液染色)。


    (七)觀察用中倍鏡選擇分散適度,不重迭的染色體分裂相,轉(zhuǎn)高倍鏡詳細(xì)觀察小白鼠染色體的形態(tài)特征,并計(jì)算2n的染色體數(shù)目。


    觀察細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn):

    1、細(xì)胞完整,輪廓清晰,染色體分布在同一水平面上。


    2、染色體形態(tài)和分布良好。


    3、最好無重疊,即使有個別重疊,也要能明確辯認(rèn),以免差錯。


    4、觀察的細(xì)胞處于同一有絲分裂階段,即染色體螺旋化程度或染色體長短大致一樣。


    5、在所觀察的細(xì)胞周圍,沒有離散的單個或多個染色體存在,以免影響計(jì)數(shù)。


    注意事項(xiàng)

    1.提前3-4小時注射秋水仙素,時間太長或者太短都會影響染色體中期的數(shù)目和形態(tài)。

    2.在低滲過程中,時間和吹打都很重要,低滲過渡會導(dǎo)致染色體膨脹,染色后肥胖,低滲時間不夠,染色后染色體顏色深,看不出條帶。

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