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大鼠肺成纖維細胞原代培養(yǎng)實驗——胰酶消化法
發(fā)布時間： 2021-12-04 點擊次數(shù)： 1336次材料與儀器
Wistar乳鼠
PBS 牛血清 青霉素 鏈霉素 EDTA 胰酶 碘酒 酒精
綿球 科直剪 眼科彎剪 眼科直鑷 眼科彎鑷 玻璃平皿 塑料培養(yǎng)瓶步驟
一、實驗材料準備
1. 動物出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。
2. 試劑
PBS、培養(yǎng)液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml 青鏈霉素、1%明膠PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精綿球。
3. 器械眼科直剪2把、眼科彎剪2把、眼科直鑷2把、眼科彎鑷2把、玻璃平皿3套，25 cm2塑料培養(yǎng)瓶(Costar)。
二、具體操作
1. 明膠包被培養(yǎng)瓶過夜(準備2-3個)，取出明膠，用2 ml培養(yǎng)液沖洗培養(yǎng)瓶一遍，置于超凈臺中。
2. 解剖取肺：將乳鼠在酒精中浸泡后取出，轉移至超凈臺上的玻璃培養(yǎng)皿中，用碘酒消毒胸部皮膚，再用酒精棉球脫碘。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪開皮膚，充分撕拉開，再用酒精棉球消毒，繼而以另一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開肋骨，然后在切口中間橫剪胸骨。用眼科鑷取出肺，置于盛有PBS(含有200 U/ml青鏈霉素)的玻璃平皿中，沖洗去血。
3. 用眼科剪將肺分成幾個肺葉，用鑷子去除周邊的血凝塊及纖維組織，用眼科剪剪去肺門處的支氣管和血管，再用含有雙抗的PBS沖洗1遍。
4. 用眼科彎剪將肺組織剪碎成1 mm3大小，加入含有雙抗的PBS，將肺組織塊吹打開，靜置15 min后，更換新的PBS。
5. 用200 ul微量加樣器(最好是超凈臺中專用的，臨用時用酒精綿球好好擦拭槍柄)取200 ul加樣槍頭一個，剪去尖，在酒精燈上用火焰燒彎。用槍頭吸取組織塊接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶20-25塊左右，每小塊間距0.5 cm左右。組織塊放置好后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉，讓瓶底朝上，向瓶內加入2 ml左右的培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶傾斜放置在溫箱中，干貼壁2-4 h后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉平放，繼續(xù)靜置培養(yǎng)。注意上述操作過程中動作要輕柔，讓液體慢慢覆蓋組織小塊，嚴禁動作過快致使液體產生的沖力使粘貼的組織塊漂起而造成原代培養(yǎng)失敗。48 h后換液，更換2-3 ml即可。
6. 貼塊貼壁72 h后，鏡下可見大量的成纖維細胞爬出，將組織塊去除，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，待細胞長滿，即可傳代。注：因為血清濃度低，內皮細胞可以爬出少量，但是很快就會死掉。
2.7 傳代用0.25%胰酶常規(guī)消化，以1:2傳代，傳代完后，采用差速貼壁法純化一次，即待細胞貼壁1.0 -1.5 h后(即絕大多數(shù)成纖維細胞都已經貼壁)，棄去未貼壁的細胞和培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液。成纖維細胞為長梭形形態(tài)，常呈漩渦狀生長。
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