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    初代細(xì)胞培養(yǎng)——消化培養(yǎng)法

    發(fā)布時(shí)間: 2021-11-08  點(diǎn)擊次數(shù): 1575次
    材料與儀器

    組織
    Hanks 培養(yǎng)液 胰蛋白酶
    吸管 平皿 培養(yǎng)瓶 燒杯 攪拌器 三角燒瓶 不銹鋼篩 眼科剪 眼科鑷 計(jì)數(shù)板

    實(shí)驗(yàn)步驟

    1.  準(zhǔn)備

    取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺(tái)面,紫外線消毒20 分鐘;


    2.  布局

    點(diǎn)燃酒精燈(或煤氣燈),安裝吸管帽(應(yīng)通過火焰);

    3.  處理組織

    把組織塊置入燒杯中,用Hanks液漂洗2~3 次,去除血污;如懷疑組織可能污染,可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60 分鐘;

    4.  剪切

    用眼科剪把組織塊切成2~3 毫米大小的塊(用手術(shù)刀割亦可),以便于消化;加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角燒瓶中,結(jié)扎瓶口或塞以膠塞;

    5.  消化

    或用恒溫水浴,或置入37 ℃溫箱消化均可,消化中每隔20 分鐘應(yīng)搖動(dòng)一次,如用電磁恒溫?cái)嚢杵飨茫ㄏ捌恐行柚靡粺o菌攪棒);消化時(shí)間依組織塊的大小和組織的硬度而定;

    6.  分離

    在消化過程中見消化液發(fā)混濁時(shí),可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察,如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞,立即終止消化,隨即通過適宜不銹鋼篩,濾掉尚未充分消化開的組織塊(必要時(shí)可繼續(xù)進(jìn)行消化);低速(500~1000 轉(zhuǎn)/分)離心消化液5 分鐘,吸出上清,加入適量含有血清的培養(yǎng)液(如有其它酶或EDTA 等消化,需用Hanks液洗脫一兩次后,再加入培養(yǎng)液);

    7.  計(jì)數(shù)

    用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大,再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后,分裝入培養(yǎng)瓶中;對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來說,pH 要求在7.2~7.4范圍,培養(yǎng)液呈微紅色,如顏色偏黃,說膽液體變酸,可用NaHCO3調(diào)整;

    8.  培養(yǎng)

    置入36.5 ℃溫箱培養(yǎng);如用CO2溫箱培養(yǎng),瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞,紗布塞易生霉菌,每次換液時(shí)需更換新塞。



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