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    DNA載體構(gòu)建——【干貨】三圖讓你秒懂質(zhì)粒圖譜

    發(fā)布時間: 2021-08-24  點擊次數(shù): 14215次

    很多人拿到一個質(zhì)粒圖譜,第一反應(yīng)只能是仰天長嘯,這是什么玩意?這些 ori、RBS、tet 是什么鬼?這些箭頭代表什么,轉(zhuǎn)錄的方向嗎?為什么都不相同,不會“撞車"么? 來,看幾張圖,上面的問題就能一一破解。


    第一步:先了解質(zhì)粒的基本組成元素。


    DNA載體構(gòu)建——【干貨】三圖讓你秒懂質(zhì)粒圖譜


    1)復(fù)制起始點 Ori。該位點決定了質(zhì)粒的宿主及質(zhì)粒的拷貝數(shù),它是質(zhì)粒中一段特定序列,富含 AT 和重復(fù)序列。

    Tips:圖譜上只有一個 Ori,表示質(zhì)粒是原核克隆表達(dá)質(zhì)粒;有兩個 Ori,則表示該質(zhì)粒是,穿梭質(zhì)粒,即可在原核也可在真核中復(fù)制。

    2)抗性篩選基因。圖譜中 Kan/tet 就是抗生素抗性基因,方便后續(xù)通過抗生素篩選陽性克隆。特點就是單詞最后會以大寫 R 或上標(biāo) r 結(jié)束。

    Tips:一般克隆載體只有一種抗性篩選標(biāo)記,部分表達(dá)載體及穿梭質(zhì)粒具有兩種抗性篩選標(biāo)記。

    3)多克隆位點(MCS),即一系列限制性內(nèi)切酶酶切位點,是外源 DNA 插入位點,一般可通過酶切/連接方式將外源 DNA 插入質(zhì)粒,外源 DNA 一般小于 10kb,而片段越長,轉(zhuǎn)化效率越低。

    Tips: 一般位于轉(zhuǎn)錄啟動和轉(zhuǎn)錄終止信號之間;所包含的限制性內(nèi)切酶位點數(shù)量和組成因載體不同會有所差異,且其中的酶切位點在質(zhì)粒中為單一的酶切位點;同時在使用時需注意質(zhì)粒載體與外源 DNA 酶切位點的兼容性問題熒光標(biāo)記或蛋白標(biāo)簽序列。蛋白純化標(biāo)簽蛋白:His-Tag,GST-Tag 等;蛋白檢測標(biāo)簽蛋白:Myc-Tag,F(xiàn)lag-Tag,HA-Tag 等;熒光蛋白表達(dá)標(biāo)簽:GFP,mCherry 等。


    第二步:看質(zhì)粒是否是表達(dá)載體,如果是,那就必定有這些原件:啟動子-核糖體結(jié)合位 點-克隆位點-轉(zhuǎn)錄終止信號。


    DNA載體構(gòu)建——【干貨】三圖讓你秒懂質(zhì)粒圖譜

    1、啟動子:促進(jìn) DNA 轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列,可與 RNApol 特異性結(jié)合。

    2、增強(qiáng)子/沉默子:前者是真核基因組中一種增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序,其作用與增強(qiáng)子所在位置或方向無關(guān)。后者是負(fù)增強(qiáng)子,負(fù)調(diào)控序列。

    3、核糖體結(jié)合位點/起始密碼/SD 序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA 有核糖體的兩個結(jié)合位點,對于原核而言是 AUG(起始密碼)和 SD 序列。

    4、轉(zhuǎn)錄終止順序(終止子)/翻譯終止密碼子:結(jié)構(gòu)基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA  的保守序列,此位點 down-stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū),這 2 部分共同構(gòu)成 poly(A)加 尾信號。


    第三步:弄清楚方向,即為何質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時針而有的箭頭逆時針。


    DNA載體構(gòu)建——【干貨】三圖讓你秒懂質(zhì)粒圖譜

    其實那是代表兩條 DNA 鏈,即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈 DNA,它的啟動子等在其中一條鏈上,而它的某些基因在另一條鏈上。當(dāng)然,最重要的是要弄清楚目的基因插入那一段(從 T7 啟動子到終止子那一段)的方向,即下圖黃色圈圈所示的箭頭方向,其它的大可以忽略。


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